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高通量测序
重磅上线 | circRNA全长鉴定及定量新策略
来源: | 作者:geneseed | 发布时间: 2021-07-02 | 1604 次浏览 | 分享到:

引言

目前,circRNA的研究主要是基于二代测序平台。虽然二代测序可以同时对数百万个短序列读长进行测序,但是无法完整的捕获circRNA全长以及难以准确地对circRNA进行定量。随着circRNA研究的不断深入,circRNA全长序列的鉴定和分析变得越来越重要。但如何才能分析和得到circRNA的全长序列呢?有没有新的策略能直接实现这个目标?

 

答案是肯定的?!熬由且煲?,善假于物也?!闭饩浠耙埠苁屎嫌谀擅卓撞庑蚣际?。凭借其长读长的优势(就怕你不够长)完爆二代测序短读长的特点。吉赛生物最新推出的circRNA测序服务——基于纳米孔测序circRNA全长鉴定和定量,就是此“物”,旨在探寻“君子”之芳容。

 

如何探寻?

利用随机引物对富集后的circRNA进行滾环反转录扩增,使用纳米孔测序技术circRNA的全长序列进行直接测序,并通过特定算法实现circRNA 表达定量和变异转录本全长序列的识别。

 

 

实验室原理图

 

生信分析内容及流程图

 

 

“芳容”如何?

1.测序文库大小

我们都知道,测序文库的大小在某种程度上会对 circRNA 分子的检出率以及定量造成影响,因此可通过特定算法的校正,选择最佳的检测长度,从而使circRNA分子的检出率达到最佳,完整捕获circRNA分子,无须像二代测序那样用算法去拼接。

 

图1. 纳米孔测序文库长度与数据量直方图

 

2、circRNA检出率

 

 

图2. Nanopore与Illumina测序 circRNA 丰度比较。多物种以及多种生理状态显示,Nanopore的 circRNA 有效检出率远高于Illumina测序。


3、可变剪切事件

 

3. Nanopore 全长鉴定 circRNA 隐藏且复杂的转录及可变剪切图谱



 

4. mmu-circMsrb3_0004 在小鼠心脏/脑中的表达水平

 

 

小鼠基因 Msrb3 只包含 3 个线性转录本,却能够转录至少 10 个环状转录本分子(如图3)。

Nanopore 全长技术鉴定出的 circRNAs 多种多样,包括

exonic circRNAs

EIciRNAs

intronic circRNAs

相比 Illumina 仅仅检测 BSJ,Nanopore 全长鉴定能够观察到 circRNA 真实的内部构造,甚至发现新的 circRNA 外显子(如图3中红色框)。

特别地, Nanopore 以及 NGS 都检测到 mmu-circMsrb3_0004 在小鼠心脏/脑中有较高的表达(如图4),Nanopore 全长鉴定更是识别到该环状分子的 3 isoforms。

 

 

4、GO/Pathway富集分析Nanopore sequencing)

a

 

 

b

 

 

c

 

图5. 癌症/癌旁差异分析及功能富集分析表明差异circRNA 参与神经相关功能与通路

 

 

欣赏circRNA的 “芳容”,我们可以发现纳米孔测序技术在检测circRNA上的优势:


更强的检出率

相比二代测序,纳米孔测序可以将circRNA reads检测效率提高20倍以上


更高灵敏度

可识别低丰度的circRNA,能够更敏感地捕获到非经典circRNA,i.e. intronic


准确识别变剪切事件(特有)

纳米孔测序能够完整地捕获RNA分子,无须拼接,可识别 circRNA 隐藏的复杂结构

 

我们都知道,circRNA在总RNA中的比例是非常低的,并且受到组织类型与组织状态等的影响。但是在纳米孔测序技术中,我们仅需要1 μgtotal RNA起始量即可完成纳米孔的建库与测序(circRNA二代测序至少也需要2 μg的起始量)。所以纳米孔测序技术在circRNA的全长鉴定和定量中是大有作为的。我们在前面的文章也有做过相关文章的解读:

circRNA研究新策略 | 三代测序是否能引领circRNA走向未来


吉赛生物在基于纳米孔测序的circRNA全长鉴定和定量的研究服务中已具有丰富的经验,形成了一套完整的解决方案?;队蠹掖寡?!

 

 

 

 

 



高通量测序?
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